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徐銘恩:3D打印肝組織單元在藥物篩選中的作用

時(shí)間:2016-08-30 09:51 來(lái)源:3D打印在線(xiàn) 作者:中國(guó)3D打印網(wǎng) 閱讀:

徐銘恩教授

徐銘恩教授

肝臟是人體藥物代謝的主要器官,通過(guò)研究藥物在肝臟中的代謝機(jī)制,可以幫助我們篩選針對(duì)某些疾病的藥物。而通過(guò)3D生物打印技術(shù)打印出的肝組織,可以代替實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或器官,應(yīng)用于我們的藥物篩選中。

肝組織單元與3D打印

肝臟是由大概50-100萬(wàn)的肝小葉結(jié)構(gòu)組成的。因此,我們的設(shè)想是,如果能夠在體外把肝小葉結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)好打印出來(lái),并且使它具有功能,就能夠像集成電路一樣把它們集成起來(lái),最后變成一個(gè)肝臟。因此,我們的關(guān)注點(diǎn)是在怎樣構(gòu)建肝小葉的層次上的。

肝小葉有很多特殊的結(jié)構(gòu),如中央靜脈、肝板、肝血竇等。除了細(xì)胞本身的表型以外,這些結(jié)構(gòu)對(duì)于最后功能的實(shí)現(xiàn)也會(huì)有影響,這也是3D打印的特長(zhǎng)所在,因此我們通過(guò)增加表面積、增加內(nèi)部液體的湍流等,研究了這些結(jié)構(gòu)對(duì)肝臟的影響。

組織的打印與細(xì)胞的培養(yǎng)

首先我們打印了如正方形、三角形等不同結(jié)構(gòu)的組織,在這些組織中,細(xì)胞會(huì)不停地復(fù)制分裂,然后形成一個(gè)一個(gè)的微球。這個(gè)微球會(huì)進(jìn)一步發(fā)展,到第13天的時(shí)候,這些微球之間會(huì)發(fā)生連接并融合。長(zhǎng)到30天的時(shí)候,組織內(nèi)部會(huì)形成一些典型結(jié)構(gòu),一個(gè)就是支架完全被打印進(jìn)去的肝臟細(xì)胞所替代,除了替代掉的之外,還有一些材料沒(méi)有降解掉的,在這部分材料中也有一些細(xì)胞團(tuán)的存在。因?yàn)閮?nèi)部出現(xiàn)了低氧的環(huán)境,所以組織里面自發(fā)地出現(xiàn)了非常多的類(lèi)似血管的通道,保證了內(nèi)部養(yǎng)分的供應(yīng)。

通過(guò)激光共聚焦的方式,我們可以觀察內(nèi)部細(xì)胞的存活情況。從13天的數(shù)據(jù)來(lái)看,存活率是比較高的,而之后存活率也一直保持了一個(gè)比較高的狀態(tài)。

打印過(guò)程中的質(zhì)量控制

在培養(yǎng)出了具有結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的組織以后,我們?cè)谘芯抗δ艿臅r(shí)候發(fā)現(xiàn),功能的標(biāo)準(zhǔn)偏差非常大。這到底是因?yàn)榧?xì)胞功能、打印處理或者誘導(dǎo)的問(wèn)題,還是本身結(jié)構(gòu)的問(wèn)題呢?

結(jié)構(gòu)問(wèn)題是我們?cè)诩?xì)胞表型后需要考慮的,因?yàn)樗z是非常軟的一種材料,在打印過(guò)程中,就有較大的形變。我們建立了一套復(fù)合合多種成像技術(shù)和處理算法的系統(tǒng),對(duì)打印結(jié)構(gòu)進(jìn)行一個(gè)深度檢測(cè)和分析。在整個(gè)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn),其實(shí)打印過(guò)程已經(jīng)出現(xiàn)了非常多的問(wèn)題,比如材料形變以及交聯(lián)過(guò)程中控制的不準(zhǔn)確等。

在此基礎(chǔ)上,我們建立了一系列的算法,對(duì)材料的孔徑、連通率、表面積等因素做了定量化的分析。利用這些算法我們可以做一個(gè)質(zhì)控,使得打印的結(jié)構(gòu)更為精準(zhǔn)地符合我們的設(shè)計(jì)。雖然生物本來(lái)就是非線(xiàn)性的,但是我們發(fā)現(xiàn),對(duì)于結(jié)構(gòu)的控制是線(xiàn)性相關(guān)的,這意味著我們可以對(duì)整個(gè)過(guò)程進(jìn)行精準(zhǔn)的反饋控制。相比之下,如果沒(méi)有基于這套量化分析的算法,不做控制打印出來(lái)的結(jié)構(gòu)的差異性是非常大的,而結(jié)構(gòu)的不同直接帶來(lái)了細(xì)胞生物活性的不一樣。

檢測(cè)細(xì)胞增殖

在排除掉結(jié)構(gòu)以及增殖過(guò)程對(duì)結(jié)構(gòu)的破壞因素之后,我們對(duì)細(xì)胞的增殖情況做了檢測(cè)。

細(xì)胞的增殖開(kāi)始有個(gè)快速的增長(zhǎng)過(guò)程,接著會(huì)進(jìn)入一個(gè)相對(duì)緩慢的增長(zhǎng)過(guò)程。大概在17-22天以后,細(xì)胞增殖進(jìn)入了一個(gè)相對(duì)平臺(tái)期,此時(shí)我們可以檢測(cè)它們的一些基本因素。比如白蛋白,而白蛋白的分泌在8周的時(shí)間里一直維持在一個(gè)比較平穩(wěn)的分泌水平。當(dāng)然,P450酶系、CYP3A4基因的表達(dá)等,也都是我們關(guān)注的點(diǎn)。

從整體上來(lái)看,跟平面培養(yǎng)的數(shù)據(jù)相比,3D打印之后的細(xì)胞內(nèi)一些P450酶系基因的表達(dá)不但沒(méi)有增加,反而開(kāi)始降低了,特別是到2-3天的時(shí)候達(dá)到一個(gè)低值。在排除掉打印過(guò)程中壓力和剪切力等導(dǎo)致了細(xì)胞表型發(fā)生變化等這些因素后,我們發(fā)現(xiàn)主要的原因應(yīng)該是長(zhǎng)時(shí)間平面培養(yǎng)的這些細(xì)胞在重新回到3D的環(huán)境下,本身就有一個(gè)適應(yīng)期。

肝單元生物3D打印機(jī)首次亮相世界3D打印技術(shù)產(chǎn)業(yè)大會(huì)暨博覽會(huì)

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藥物試驗(yàn)

過(guò)了66個(gè)小時(shí)之后,細(xì)胞增殖的數(shù)量就開(kāi)始上升,大概20天以后,我們用利福平這一典型的用來(lái)做肝損的陽(yáng)性藥物的實(shí)驗(yàn)。

我們?cè)O(shè)置了平面對(duì)照,發(fā)現(xiàn)差異非常大,不管這種差異是不是更接近于人體真實(shí)情況,差異的存在本身就意味著平面和3D之間存在區(qū)別,說(shuō)明這個(gè)研究是有價(jià)值的。

比如說(shuō)我們這里利福平它明顯地呈現(xiàn)對(duì)肝功能更為長(zhǎng)時(shí)間的影響。首先是三維條件下CYP3A4的表達(dá)相比平面的表達(dá)時(shí)間更長(zhǎng)。第二在利福平的作用下會(huì)有一些長(zhǎng)期的毒性顯示出來(lái)。

圍繞利福平,我們又做了一系列的數(shù)據(jù),包括從CYP2B6,MRP2,BSEP等一系列跟肝臟藥物代謝相關(guān)的基因表達(dá),跟平面之間都存在顯著差異。還有苯巴比妥、奧美拉唑等幾個(gè)典型的陽(yáng)性藥物,在這樣的模型中相比傳統(tǒng)的平面是有區(qū)別的。

在這個(gè)基礎(chǔ)上,我們嘗試開(kāi)發(fā)高通量篩選技術(shù)。高通量篩選需要基于在線(xiàn)即時(shí)檢測(cè)的技術(shù)。我們建立了包含多個(gè)叉指電極陣列的芯片,它依靠的是細(xì)胞跟電極之間接觸的阻抗來(lái)在線(xiàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖、遷移和死亡情況。

打印之后有幾個(gè)問(wèn)題要解決。這種電極的設(shè)計(jì)是針對(duì)培養(yǎng)在平面的細(xì)胞,而現(xiàn)在細(xì)胞跟材料混在一起,我們需要確認(rèn)在這種情況下能否測(cè)到它的增殖和死亡情況。

我們做了一系列的測(cè)試,包括加不同的溶液,檢測(cè)頻率等條件,看它對(duì)細(xì)胞的信號(hào)的檢測(cè)有沒(méi)有影響。我們用傳統(tǒng)的Alamar bule實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞芯片的方式檢測(cè)過(guò)組織的增殖過(guò)程,在線(xiàn)性上是基本一致的。

腫瘤藥物篩選所希望的結(jié)果是,篩選出的藥物能夠最大程度殺死腫瘤細(xì)胞同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的損傷最小。我們把肝臟組織和和腫瘤組織打印在一塊芯片上,從陽(yáng)性藥物檢測(cè)來(lái)看,這個(gè)模型可以進(jìn)行精準(zhǔn)篩選。

同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn),一些需要肝臟二次代謝物才有很強(qiáng)的抗腫瘤毒性的藥物,在這個(gè)模型中也能被篩選出來(lái)。

我們今后想做的一些工作是,比如通過(guò)集成將多種組織在一塊芯片上,然后加上肝臟看他們之間的反應(yīng)。

最后做一個(gè)總結(jié),首先我覺(jué)得3D打印這個(gè)技術(shù)在個(gè)性化需求強(qiáng)烈的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用價(jià)值,對(duì)于科學(xué)研究來(lái)說(shuō)它是一個(gè)很好的工具。特別是這個(gè)工具可以有可控結(jié)構(gòu)的材料以及可以把細(xì)胞打印成特殊的結(jié)構(gòu)。無(wú)論為組織工程也好,藥物的精準(zhǔn)化篩選、個(gè)性化給藥也好,都是提供了一種全新的可能。

(責(zé)任編輯:admin)

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