基于人誘導多能干細胞來源心肌細胞的功能性心肌組織直接3D打印構建(2)
時間：2023-11-02 09:33 來源：生物打印與再生工程 作者：admin 閱讀：次
三、環形功能性心臟組織的可重復和準確的3D生物打印
為了生產有層次結構的組織或器官，控制細胞分布是很重要的。因此，在印刷前需要將細胞摻入油墨中。為了評估細胞的添加是否會影響墨水的可打印性，該團隊將25 Mio/ml hiPSC-CMs加入到CollHA3-3墨水中，用以打印環狀組織。所得到的環是穩定的，并表現出良好的均勻性 (圖3a)。
在組織構建后(第0天)和制造后7天（第7天)使用鈣黃素- am /乙錠同二聚體-1（EthD-1)對打印的組織和通過滴鑄生產的組織進行染色。在任何時間點，鑄型組織和打印組織的活力均無顯著差異。在第30天通過免疫熒光染色觀察hiPSC-CMs的切片和整個組織的形態和分布。打印的hiPSC-CMs顯示出典型的肌合成α-肌動蛋白條紋，以及緩慢的骨骼肌鈣蛋白- i (ssTnI)和心臟肌鈣蛋白- i (cTnI)(圖3b)。打印組織中α-肌動蛋白的表達均勻分布(圖3c)。同時，ssTnI的表達水平向組織邊緣升高，證明了打印的hiPSC-CMs的行為與分化和鑄造的hiPSC-CMs相似，表明了打印的hiPSC-CMs生成了有組織的肌瘤，并且具有相互連接的不同成熟狀態的hiPSC-CMs。
45個打印組織中在第3天已經表現出了自發的同心收縮(圖3D)。通過Fluo-4熒光強度的增強和減弱反映了打印組織在收縮周期中表現出鈣的同步流入和流出 (圖3f)。測量不同區域的熒光強度可以識別出起搏中心(ROI3，圖3g)，其行為隨著時間的推移顯示出高同步性，遠處區域達到熒光強度峰值的延遲約為100 ms(1幀)(圖3g)。這進一步證明了hiPSC-CMs在打印組織內形成了相互連接的網絡。
為了適用于作為模型系統或移植，工程心臟組織必須對藥物刺激表現出生理反應。因此，對打印組織首先用腎上腺素能激動劑苯腎上腺素(PE)處理，然后用維拉帕米(Ver)處理（一種l型鈣通道抑制劑）。PE刺激導致收縮頻率翻倍，但收縮程度并無顯著變化(圖3i,j)。隨后加入維拉帕米，收縮停止(圖3i,j)。
圖3 打印hiPSC衍生的心肌細胞形成功能性心臟組織
四、打印的心臟組織對被動阻力施加同心力
為了檢驗打印的環是否可以施加類似于心臟的同心圓力，該團隊設計并制造了由六個柔性柱組成的陣列(圖4a)。將打印的環轉移到柱陣列上，并在柱子周圍壓實，培養至第30天(圖4b)。在收縮周期中，打印的環能夠同步使6根柱子發生偏轉，說明它們能夠對阻力施加同心圓力。
與自由漂浮的環一樣，這些環在第3天出現了自發收縮。到第28天，收縮頻率在每分鐘20次左右保持穩定，第30天略有下降(圖4c)。在第30天進行PE和Ver處理。PE刺激顯著增加了被動機械刺激環的收縮頻率 (圖4f)。根據柱撓度計算打印組織的產生的力，PE刺激后產生的力增加(圖4g)。Ver處理顯著降低了收縮頻率和產生的力，24個環中有22個停止了跳動(圖4f、g)。這里打印的環所產生的力與僅由人類多能干細胞衍生的心肌細胞產生的力相似。
圖4 打印的心臟組織對被動阻力施加同心力
五、膠原蛋白/透明質酸墨水3D生物打印人類心臟心室功能模型
為了測試該方法是否能夠實現人類心臟心室功能模型的3D生物打印，團隊設計并打印了一個高度為14毫米，最寬處直徑為8毫米的模型(圖5a)。
心室在制造后7天達到穩定，并發生自發的同步收縮，在培養過程中持續長達100天(圖5b,c)。此外，PE刺激可使培養30 天的打印心室模型收縮頻率加快 (圖5d)。對染色心室的分析顯示，hiPSC-CMs在第100天顯現出典型的α-肌動蛋白和cTnI的條紋(圖5e)。hiPSC-CMs分布在整個打印組織中，α-肌動蛋白和cTnI表現出相似的表達模式(圖5f)。實驗表明：該組織至少可以培養100天。
圖5 凝膠方法使功能心室模型的3D生物打印成為可能
總結
本文展示了直接打印嵌入膠原基生物墨水的hiPSC-CMs生成功能性心臟組織的方法。以下結果可有力支持這一結論：hiPSC-CMs可以精確且可重復地3D生物打印成多種形狀的心臟組織，并形成相互連接的、自發和同步收縮網絡，并且可以通過藥物刺激來調節頻率；打印組織能夠對抗被動阻力發生收縮。這里開發的方法為生成復雜的功能性心臟組織開辟了新的可能性：直接打印hiPSC-CMs以及打印其他細胞類型的方法，可用于打印健康和患病的心臟模型。此外，精確放置不同心肌細胞亞型的能力，加上在生物墨水中添加導電材料的技術，在未來可以進一步模擬整個組織中的動作電位傳播，以更準確地復制心臟電生理。
參考文獻
Tilman U. Esser, Annalise Anspach, Katrin A. Muenzebrock, Delf Kah, Stefan Schrüfer, Joachim Schenk, Katrin G. Heinze, Dirk W. Schubert, Ben Fabry, Felix B. Engel*(2023). Direct 3D-bioprinting of hiPSC-derived cardiomyocytes to generate functional cardiac tissues
https://doi.org/10.1002/adma.202305911
(責任編輯：admin)
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