浙江大學(xué)王毅及賀永團(tuán)隊(duì)：生物水凝膠微結(jié)構(gòu)快速制造方法助力心肌細(xì)胞定向可控生長
時(shí)間：2022-09-14 14:02 來源：EngineeringForLife 作者：admin 閱讀：次
生物水凝膠上的微/納米結(jié)構(gòu)廣泛用于誘導(dǎo)細(xì)胞圖案化。傳統(tǒng)的光刻技術(shù)制造模具既耗時(shí)又昂貴，并且由于生物水凝膠軟脆的特性，過大的脫模力還極易導(dǎo)致微結(jié)構(gòu)損壞。近期，EFL團(tuán)隊(duì)與藥學(xué)院王毅教授合作提出了一種快速批量制造細(xì)胞圖案的新方法，使用高精度3D打印模具，通過揭示熱-光交聯(lián)固化機(jī)制，實(shí)現(xiàn)低濃度-低取代率的GelMA水凝膠微結(jié)構(gòu)高質(zhì)高效制造。利用該方法，可以穩(wěn)定且低成本地制造特征尺寸為6-80μm任意定制的水凝膠圖案。在超軟水凝膠及高精度微結(jié)構(gòu)的支持下，心肌細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)每分鐘216次（BPM）的持續(xù)自發(fā)搏動(dòng)，接近大鼠心臟的自然搏動(dòng)速率（300
BPM）。這項(xiàng)工作為細(xì)胞圖案化提供了一個(gè)通用方案，能廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)、藥物測(cè)試篩選等領(lǐng)域。相關(guān)工作“Rapid and mass
manufacturing of soft hydrogel microstructures for cell patterns
assisted by 3D printing”近期發(fā)表在Bio-Design and
Manufacturing雜志上，浙大機(jī)械學(xué)院何超凡博士生與浙大藥學(xué)院王雪純博士為共同一作，浙大機(jī)械學(xué)院的賀永教授和藥學(xué)院的王毅教授為共同通訊作者。
材料與細(xì)胞的相互作用是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。除了生化特性，材料表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞行為也有重要影響。許多研究表明，接近細(xì)胞大小的微/納米結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞具有“接觸引導(dǎo)”效應(yīng)，即細(xì)胞的生長方向與該結(jié)構(gòu)趨于一致，這一效應(yīng)已在許多細(xì)胞中得到驗(yàn)證。然而，現(xiàn)有的細(xì)胞-基質(zhì)相互作用研究大多基于生物相容性較差的材料，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、硅、石英等，其主要原因是高效高質(zhì)制造軟脆水凝膠微結(jié)構(gòu)仍然是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)，低濃度-低取代率的水凝膠更是如此。本文采用高精度DLP打印工藝制造了超精密結(jié)構(gòu)的模具，并翻模出軟的PDMS模具，與光刻技術(shù)相比設(shè)計(jì)靈活性及效率有較大提升。將GelMA溶液澆鑄在模具上進(jìn)行熱-光交聯(lián)，與光交聯(lián)GelMA (PGelMA)相比，熱光交聯(lián)GelMA (TPGelMA)在保持良好的生物相容性、降解性和可調(diào)性的同時(shí)，更有彈性。其核心的機(jī)制是隨著溫度的降低，三螺旋結(jié)構(gòu)（THS）的部分恢復(fù)會(huì)導(dǎo)致GelMA的溶液-凝膠化轉(zhuǎn)變。熱光交聯(lián)的凝膠TPGelMA，其力學(xué)性能的提高能大幅降低脫模過程中微結(jié)構(gòu)的破壞。
圖1 軟脆水凝膠微結(jié)構(gòu)制造方法
為驗(yàn)證三螺旋結(jié)構(gòu)（THS）對(duì)GelMA水凝膠性能的影響，比較了EFL-GM30、GM60、GM90三種典型取代率GelMA的CD光譜。這三條線在198 nm附近都有一個(gè)負(fù)峰，與膠原蛋白類似。峰幅值隨著取代率的增加而減小，說明MA基團(tuán)的引入破壞了明膠鏈上原有的氨基酸序列，阻礙了THS的形成。GM30在不同溫度下的CD光譜也顯示，隨著溫度的降低，促進(jìn)了THS的形成。FTIR分析顯示，TPGelMA光譜的峰值更高，頻率也發(fā)生了顯著變化，這與氫鍵數(shù)量的增加密切相關(guān)。在機(jī)械強(qiáng)度方面，TPGelMA的楊氏模量和抗拉強(qiáng)度均明顯高于PGelMA。隨著取代率的增加，強(qiáng)度增加比逐漸降低，說明MA基團(tuán)的引入阻礙了THS的形成，這與CD光譜的結(jié)果一致。兩種GelMA在不同溶劑中的體積變化率也不同。結(jié)果表明，TPGelMA在去離子水、PBS溶液和75%乙醇溶液中的體積變化明顯小于PGelMA，表明TPGelMA的分子網(wǎng)絡(luò)更致密。
圖2 熱-光交聯(lián)水凝膠的性能
水凝膠潮濕、軟脆的特性使其力學(xué)數(shù)據(jù)難以準(zhǔn)確測(cè)量。到目前為止，對(duì)水凝膠力學(xué)性能的研究大多僅限于壓縮試驗(yàn)上。為解決這一問題，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)方案，以準(zhǔn)確獲取水凝膠拉伸、壓縮、剪切、黏附等各種力學(xué)數(shù)據(jù)。并在此基礎(chǔ)上，建立了水凝膠在脫模過程中的粘附和損傷模型。拉伸試驗(yàn)結(jié)果表明，TPGelMA的楊氏模量、抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率顯著提高。當(dāng)應(yīng)變達(dá)到200%后，應(yīng)力-應(yīng)變曲線斜率明顯增大，為“應(yīng)變硬化”效應(yīng)。這種現(xiàn)象并沒有發(fā)生在PGelMA中。在整個(gè)拉伸過程中，PGelMA的應(yīng)力-應(yīng)變曲線始終是線性的。這可能是因?yàn)槠浞肿泳W(wǎng)絡(luò)比較松散，在分子鏈取向趨于一致之前就斷裂了。在剪切實(shí)驗(yàn)中，TPGelMA也表現(xiàn)出更好的力學(xué)性能。而在粘附實(shí)驗(yàn)中，TPGelMA的粘附強(qiáng)度雖然也有所增加，但增加幅度遠(yuǎn)低于拉伸和剪切強(qiáng)度的增加幅度，這也是TPGelMA能避免脫模損傷的重要原因。
圖3 水凝膠機(jī)械性能測(cè)試方案與損傷模型
材料與細(xì)胞的相互作用是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。除了生化特性，材料表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞行為也有重要影響。許多研究表明，接近細(xì)胞大小的微/納米結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞具有“接觸引導(dǎo)”效應(yīng)，即細(xì)胞的生長方向與該結(jié)構(gòu)趨于一致，這一效應(yīng)已在許多細(xì)胞中得到驗(yàn)證。然而，現(xiàn)有的細(xì)胞-基質(zhì)相互作用研究大多基于生物相容性較差的材料，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、硅、石英等，其主要原因是高效高質(zhì)制造軟脆水凝膠微結(jié)構(gòu)仍然是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)，低濃度-低取代率的水凝膠更是如此。本文采用高精度DLP打印工藝制造了超精密結(jié)構(gòu)的模具，并翻模出軟的PDMS模具，與光刻技術(shù)相比設(shè)計(jì)靈活性及效率有較大提升。將GelMA溶液澆鑄在模具上進(jìn)行熱-光交聯(lián)，與光交聯(lián)GelMA (PGelMA)相比，熱光交聯(lián)GelMA (TPGelMA)在保持良好的生物相容性、降解性和可調(diào)性的同時(shí)，更有彈性。其核心的機(jī)制是隨著溫度的降低，三螺旋結(jié)構(gòu)（THS）的部分恢復(fù)會(huì)導(dǎo)致GelMA的溶液-凝膠化轉(zhuǎn)變。熱光交聯(lián)的凝膠TPGelMA，其力學(xué)性能的提高能大幅降低脫模過程中微結(jié)構(gòu)的破壞。
圖1 軟脆水凝膠微結(jié)構(gòu)制造方法
為驗(yàn)證三螺旋結(jié)構(gòu)（THS）對(duì)GelMA水凝膠性能的影響，比較了EFL-GM30、GM60、GM90三種典型取代率GelMA的CD光譜。這三條線在198 nm附近都有一個(gè)負(fù)峰，與膠原蛋白類似。峰幅值隨著取代率的增加而減小，說明MA基團(tuán)的引入破壞了明膠鏈上原有的氨基酸序列，阻礙了THS的形成。GM30在不同溫度下的CD光譜也顯示，隨著溫度的降低，促進(jìn)了THS的形成。FTIR分析顯示，TPGelMA光譜的峰值更高，頻率也發(fā)生了顯著變化，這與氫鍵數(shù)量的增加密切相關(guān)。在機(jī)械強(qiáng)度方面，TPGelMA的楊氏模量和抗拉強(qiáng)度均明顯高于PGelMA。隨著取代率的增加，強(qiáng)度增加比逐漸降低，說明MA基團(tuán)的引入阻礙了THS的形成，這與CD光譜的結(jié)果一致。兩種GelMA在不同溶劑中的體積變化率也不同。結(jié)果表明，TPGelMA在去離子水、PBS溶液和75%乙醇溶液中的體積變化明顯小于PGelMA，表明TPGelMA的分子網(wǎng)絡(luò)更致密。
圖2 熱-光交聯(lián)水凝膠的性能
水凝膠潮濕、軟脆的特性使其力學(xué)數(shù)據(jù)難以準(zhǔn)確測(cè)量。到目前為止，對(duì)水凝膠力學(xué)性能的研究大多僅限于壓縮試驗(yàn)上。為解決這一問題，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)方案，以準(zhǔn)確獲取水凝膠拉伸、壓縮、剪切、黏附等各種力學(xué)數(shù)據(jù)。并在此基礎(chǔ)上，建立了水凝膠在脫模過程中的粘附和損傷模型。拉伸試驗(yàn)結(jié)果表明，TPGelMA的楊氏模量、抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率顯著提高。當(dāng)應(yīng)變達(dá)到200%后，應(yīng)力-應(yīng)變曲線斜率明顯增大，為“應(yīng)變硬化”效應(yīng)。這種現(xiàn)象并沒有發(fā)生在PGelMA中。在整個(gè)拉伸過程中，PGelMA的應(yīng)力-應(yīng)變曲線始終是線性的。這可能是因?yàn)槠浞肿泳W(wǎng)絡(luò)比較松散，在分子鏈取向趨于一致之前就斷裂了。在剪切實(shí)驗(yàn)中，TPGelMA也表現(xiàn)出更好的力學(xué)性能。而在粘附實(shí)驗(yàn)中，TPGelMA的粘附強(qiáng)度雖然也有所增加，但增加幅度遠(yuǎn)低于拉伸和剪切強(qiáng)度的增加幅度，這也是TPGelMA能避免脫模損傷的重要原因。
圖3 水凝膠機(jī)械性能測(cè)試方案與損傷模型
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